背景介绍
用于测序和PCR技术以及多种抗肿瘤药物发现的高性能酶学工程需要对DNA/RNA合成过程进行详尽的分析。然而，由于涉及到复杂的分子间相互作用，还未有能够对结合性能及酶活性检测同时进行综合分析的方法体系。
本文中，我们介绍了一种依生物芯片为原理的方法，用于研究聚合酶以及它与核酸之间的互作。该种方法通过电驱动在微型电极上的DNA模版链而实现。两种测量模式同时追踪DNA摆动过程的动力学以及DNA的延伸，定量检测结合动力学，解离常数和热力学。该方法的检测灵敏性能够分辨Taq和PoI I (KF) DNA聚合酶还未经鉴定的紧密结合状态时的动力学。此外，核苷酸的无标记掺入能够被实时追踪以及在酶活性检测过程中能够观测到DNA聚合酶构象的变化。
DNA聚合酶在活细胞基因组复制中承担着重要的作用，同时也应用于生物技术领域，例如聚合酶链式反应（PCR)和DNA测序。尤其在合成测序领域（例如，纳米孔测序）。当前大量的工作着重于开发更快，更精确以及因此更加节约成本的工作流程，最终在医学应用领域实现单分子水平上的操作。出于此目的，必须设计高性能的工程化DNA聚合酶，该过程依赖于对聚合酶酶学行为的精确理解。
Figure 1描述了一个简单的DNA聚合反应过程：首先，DNA聚合酶（P）结合到寡核苷酸引物的连接部位，该寡核苷酸引物以高亲和性与互补的寡核苷酸模版DNA杂交。然后，P-DNA复合物以较弱的亲和性与脱氧核苷三磷酸（dNTP）结合，这取决于相对单链模版上的临近碱基的类型（碱基互补配对），因此优先选择互补的dNTP。最后，聚合酶通过催化引物3’端磷酸二酯键的形成引入核苷酸，从而延伸了核苷酸链并产生焦磷酸盐（PPi）。
Figure 1 DNA聚合酶链式反应过程（PCR）
从更细节的角度研究，催化反应涉及几个步骤，其中聚合酶的构象变化起着重要的作用：当聚合酶的指状结构域处于开放状态时，dNTP与P-DNA复合物结合；此后，指状结构域从开放态转变为封闭态，dNTP与酶活性位点对齐，在该位点发生化学催化反应，掺入配对的核苷酸。指状结构域再次打开后，PPi产物被释放，聚合酶向前移动到模版链上下一个核苷酸的位置。对于dNTP的错配，指状结构域呈现一定程度的关闭，这改变了结合与分离的概率，并有效地构成了一种准确性检验机制，该机制倾向于促使正确配对的碱基得以结合。因此，二元和三元复合物的形成以及稳定性可通过聚合酶，模版DNA和dNTPs的动力学常数（Kon, Koff）和解离常数（KD）进行预测。并且通过酶活性参数Kcat（转换数）和米氏常数Km=(Koff + Kcat )/Kon (达到最大转化速率时的底物浓度），可以比较不同聚合酶的性能。
然而，Figure 1中的反应路径给所采用的测量方式带来了巨大挑战，这些测量方式旨在明确各个步骤以及揭示相互之间的关系。许多互作分子的涉入（引物，模版DNA，竞争性DNA，配对/错配dNTPs, Mg2+,
蛋白质辅助因子，焦磷酸盐），会产生许多组合状态，这些状态从实验上是难以测量的，尤其当对DNA序列突变感兴趣时。此外，不同的相互作用在不同的浓度范围内产生效应，范围可从pM（P-DNA)到mM（P-Mg2+), 这需要具备较大动力学测量范围的高敏感系统进行测量。
为了评估聚合过程的功能和产量，需要能够实时检测DNA的延伸和检测聚合酶构象的瞬时改变。目前为止，还未有单一的检测方法能够实现所有的检测需求。在20世纪70年代发明的放射性标记化学淬灭法广泛的用于动力学数据检测，并且根据此方法进一步发明了自动化的stopped-flow设备。这些设备能够迅速的对溶液进行混合，但是对于放射性底物的操作依旧比较困难而且耗费人力。荧光标记对多种检测需求都是有利的，但是不能对溶液中的高亲和力相互作用进行定量，因为标记的化合物必需在nM浓度，以便能够使用荧光光谱仪进行检测。另外，标记本身可能会严重的破坏结合位点和酶活性；例如，不论是直接标记核苷酸或者使用DNA相互作用染料，染料的存在都不可避免的抑制了核苷酸的掺入。
生物传感器（Biosensor)，表面固定其中一个相互作用分子，对于复杂的反应中各个组合可进行分解，比起在溶液中检测更加合适。通过用于溶液交换的微流控通道，相互作用分子能够从反应体系中被添加或移除，以便进行实时的检测结合和解离。许多不同浓度的相互作用分子组合能够在一次实验中被检测，这允许对更加复杂的反应进行分析，加速工作流程并且使得数据解读更加清晰直观。
最初使用SPR技术（表面等离子共振）对P-DNA相互作用动力学进行测量，偶尔使用荧光和光纤法，已经通过其中一些方法观测到模版的延伸。然而，一些影响会导致人为假象，需要谨慎区分。比如质量运输限制，非特异性结合，高浓度以及高固定密度带来的重新结合效应。更为重要的是，基于目前最先进的测量手段，也无法获取有关聚合酶在 DNA 上的位置或其构象（指状结构域闭合过渡阶段）的信息。
本文中我们介绍一种方法，利用生物芯片表面，检测聚合反应过程，不需要对核苷酸或聚合酶进行标记。功能元件是核苷酸探针，以比较低的密度固定在微电极表面。通过对微电极提供交互变换的正负电压，这些探针能够改变运动方向，实时实现两种不同类型的测量：运动速度取决于探针的流体动力学摩擦系数，因此可以用于反应聚合酶的结合，与DNA的相对方向和它的构象状态。同时，对电致排列的“静止”DNA 分子的延伸长度进行了测量，从而揭示了在聚合反应过程中形成了多少个碱基对。根据这两种互补的信号，许多相互作用（亲和性，动力学，热力学）参数特性以及酶活性（延伸速率，米氏常数，聚合酶构象的改变）都可以以较高的灵敏度进行分析。这已经通过对来自于T. Aquaticus的Taq DNA聚合酶和来自于E. coli的 Pol I克伦诺片段的研究被证实。
总的来说，本文介绍了一种可用于对DNA和RNA聚合酶进行检测的方法以及通过商业化的芯片和设备而实现。
实验总结
01、测量原理
Figure 2 展示了两种互补的测量原理，这两种原理通过在金属薄膜附近检测荧光染料的淬灭现象，来获取有关表面附着的寡核苷酸的取向/伸展情况的信息。实验通过120um的微电极上固定的大约106个DNA分子层实现。光源激发的Cy3染料通过近场相互作用将能量转移到金属膜上较远的距离（>100nm)，通过发射的荧光强度，可以确定DNA上端部的高度。
Figure 2 测量原理
第一种测量原理，动力学测量模式，通过为金属微电极提供± 0.4 V正负变换的电压实现电驱动的DNA摆动（Figure 2A)。带有负电荷的DNA被带有负电荷的金属表面排斥而远离，反之，被带有正电荷的金属表面吸引而靠近。躺平和直立之间的摆动频率一般为10 kHz。运动过程由时间相关的单光子计数进行记录，每秒会产生一个荧光柱状图，解析向上和向下的运动以及躺平和直立下静止状态时的各自荧光水平。
Figure 2B比较了54个DNA碱基在Taq聚合酶结合前后以及在聚合酶催化dNMPs掺入前后的运动轨迹。通过该项工作，一段随机的36个核苷酸与互补的54个碱基模版进行杂交，称为36/54或ss-dsDNA，它的完整的双链类似物，称为54/54或dsDNA，被用于对照。由于疏水动力学产生的滞后效应，Taq聚合酶的结合降低了DNA链的运动速度，因此在时间可分辨的向上运动曲线中产生了明显的转变（tilt)。一旦加入dNTPs，曲线的倾斜变化会更加明显，表明聚合酶延伸了引物并沿着DNA向上运动。通过加入强变性剂到芯片表明去除聚合酶，而后，向上的转动轨迹与54/54对照组测量一致，证明聚合酶成功催化36/54到54/54。
第二种信号提供了关于聚合酶活性的有价值的互补信息：它测量了直立方向的DNA的绝对荧光强度。为了使得DNA保持向上，需要为芯片表面提供负电荷。一旦加入dNTPs到Taq-ss-dsDNA复合物中，荧光发生明显的增强。随着聚合酶将上半部耷拉着的单链DNA转变为刚性的双链DNA，荧光染料离开淬灭的表面。它对那些距离表面超过几纳米的柔性单链 DNA 片段影响不大，因为这些片段能够自由移动。相反，对于一个完全双链的螺旋结构而言，其表面近端部分所产生的排斥力实际上会传递到上部的 DNA 结构上，这是因为该分子呈棒状结构。
02、Taq-DNA相互作用动力学
为了实时研究Taq与ss-dsDNA（Fig. 3A)和dsDNA（Fig. 3B)的结合，我们监测运动速度，比如动力学应答信号。结合动力学通过单指数模型进行拟合。在图Figure 3C 中，将观测到的结合率 k_obs 与 Taq 浓度的关系绘制成图表，结果显示出预期的线性关系。
Figure 3 Taq与ss-dsDNA和dsDNA相互作用动力学和热力学分析
03、Taq热力学分析
为了测量先前在紧密结合状态下无法测得的热力学信息，我们在不同的温度（从 5°到55 °C）下测量结合和解离（Fig. 3D,E) 。Fig. 3F中描述了相应的解离和结合图谱。总的来说，Taq与ss-dsDNA的亲和性比与dsDNA的亲和性高一个数量级。当温度升高时，与两种DNA的结合效率都增加，而解离效率下降。因此，从 5°到55 °C亲和性提高一个数量级，解离常数接近pM级别。
04、Taq酶活性分析
通过同时检测两种信号，我们研究了在引物延伸过程中Taq聚合酶的酶活性（请见Fig. 4A,B)。由静止DNA 发出的荧光强度（Fup）则反映了引物延伸的状态（即上部带有 Cy3 标记的 DNA 端部的高度），而摆动速度（DRup）则表明了聚合酶与 DNA 的结合状态及其在 DNA 上的位置。一旦加入dNTPs，引物开始延伸，随着Cy3染料远离使其淬灭的金属表面，向上的荧光强度迅速增强（请见Fig. 4B, 荧光增加之前瞬间的降低是由于液流系统中产生了一个气泡）。同时，向上的运动速度降低是因为随着Taq接近上部DNA顶端，摩擦力增加。在到达DNA顶端后，聚合酶从当前完全的双链DNA上解离，从而可在向上的荧光信号变化中观测到单指数的解离动力学。
Figure 4 Taq酶活性测量
通过Figure 4C 中荧光上升信号的增强情况，对 Taq 的延伸活性在 5°C 至 45°C 范围内的温度变化下进行了实时分析。酶活性动力学并不取决于dNTP的浓度，表明聚合酶活性是决定速率的关键因素。
对于Pol I聚合酶的结合动力学和酶活性分析，我们将不再本文中详述。我们将对该检测体系对DNA聚合酶在发挥生物学过程中产生的构象变化的检测进行介绍。
05、Pol I指状结构域关闭状态转变的构象变化检测
据报道， 在发挥酶活性过程中，DNA聚合酶会经历构象上的转变，构象的转变能够促进正确的核苷酸掺入，帮助修复错配的dNTPs. 指状亚结构域从开放转变成关闭的状态，帮助正确的dNTP与互补碱基在合适的位置进行配对。晶体结构已经证实这种开放/关闭和部分关闭构象的存在，并通过FRET在溶液中检测到该现象，但到目前为止，还没有使用生物传感设备进行检测。由于电诱导的转动速度取决于聚合酶和它的构象变化带来的摩擦力变化，我们推测使用该方法可以检测聚合酶的指状结构域的构象变化。为了防止酶将 dNMP 包入并复制模板，我们使用了一种末端为 ddNTP 结构且缺少 3’-OH 羟基（这种羟基通常是连接 dNTP α-磷酸基与引物骨架所必需的）的引物。为了排除外切酶活性的影响，我们使用了 Pol I(KF exo−) 这种经过 D355A 和 E357A 突变的引物，这些突变消除了 3’→5’外切酶活性。
一旦加入正确的核苷酸，该方法可检测运动速率发生了明显的变化（提高2.8%）（请见Fig. 5A)。摆动的动力学加速表明聚合酶与dNTP结合后构象呈现更紧凑的状态，与预期的指状结构域关闭构象一致。
Figure 5 Pol I指状结构域与dNTP结合后构象变化检测
需要注意的是，指状结构域运动对蛋白总直径的影响是非常小的。根据Pol I(KF) 同源物的晶体结构可知，HydroPro测量下，回转半径和蛋白体积的变化仅分别从2.69nm到2.64nm（减少2.5%）以及从87.7到83.4nm（减少5%）。尽管如此，摆动的动力学测量成功解析了微小的构象变化差异，证明了该方法的灵敏度。此外，还可以通过测量 cdNTP 的浓度对构象变化的影响来推断 dNTP 的解离常数。滴定曲线遵循1:1朗格缪尔等温线，对于匹配的dNTP，KDdGTP − C = 1.0 ± 0.4 μM（请见Fig. 5B)，和在延伸动力学中监测到的结果一致。对于错配的dNTP，亲和性明显降低，为KDdTTP − C = 149 ± 53 μM（请见Fig. 5B)。因此在正确配对和错配的dNTP之间测亲和性差异可达100倍。总体来看，DNA/RNA聚合酶与模版DNA-引物复合物结合动力学以及酶延伸引物的活性情况，对于生物体至关重要，比如细胞的增殖，病毒感染等。我们介绍了一种先进的以生物芯片为基础的无标记检测方法，能够以较高的灵敏度同时检测动力学和酶活性；同时，在聚合酶发挥功能的过程中，结合dNTP后，聚合酶将会发生构象的变化，从而催化dNTP与引物3’-OH形成磷酸二酯键。该方法通过对不同构象状态时蛋白的摆动速率的测量，成功测得极微小的构象变化，为更深入的酶活性研究打下基础。
本研究中所采用的检测技术依托于 heliX+ 分子互作分析系统，该系统核心采用 switchSENSE® 技术，凭借共价偶联或标签捕获的方式，可将研究中感兴趣的分子（配体）稳定固定在 heliX® 芯片上，结合标准化的自动化工作流程，能够为生物分子间的相互作用分析提供高效、精准的整体解决方案，也为本次研究中聚合酶与 DNA 相互作用及酶活性的多参数精准检测提供了关键技术支撑，助力实现了聚合酶构象变化、结合动力学等多维度信息的高灵敏度解析。
版权声明：本文转载于今日头条，版权归作者所有，如果侵权，请联系本站编辑删除
